Fiji und ImageJ als Hilfsmittel für Mikroskopiker

[Ständerpilz]

Mit Fiji bzw. ImageJ kann man mikroskopische Aufnahmen beschriften, mit einem Maßstabsbalken versehen und Partikel (Sporen) zählen. Vermessen von Längen, Flächen und Winkeln ist ebenfalls kein Problem. Außerdem ist es open-source, kostenlos und plattformunabhängig.

Zunächst mal zu den Unterschieden von ImageJ und Fiji: Fiji ist ImageJ mit Java und einer Reihe Plug-Ins zu einem Paket zusammengeschnürt. Ansonsten gibt es keinen Unterschied. Fiji kann man hier herunter laden: http://fiji.sc/

Leider ist diese wissenschaftliche Software nicht so intuitiv zu bedienen, wie manch kommerzielle Programme. Daher gebe ich hier mal eine kurze Einleitung speziell für Hobby-Mikroskopiker.
Damit kommt man dann hoffentlich recht schnell zu brauchbaren Ergebnissen.

Eine Anmerkung noch: Man sollte generell mit Kopien von Bildern arbeiten und nicht mit den Originaldateien. Auch sollte man seine Arbeit von Zeit zu Zeit speichern, da man in Fiji/ImageJ nicht beliebig viele Schritte rückgängig machen kann.

Vermessen und Einfügen eines Maßstabsbalkens mit Fiji

Zum Vermessen ist es natürlich wichtig, dass man einen Größenmaßstab hat. Dazu benötigt man etwas mit bekannter Größe. Falls man kein Objektmikrometer (ein Objektträger mit einer mikroskopisch kleinen Skala) zur Hand hat, kann man Bärlappsporen (Lycopodium) verwenden, da diese recht größenstabil sind (30 µm +- 2 µm). Ich benutze ein Objektmikrometer und mache zunächst Fotos von der kleinen Skala mit jedem Motiv. Die Skala auf dem Objektmikrometer ist insgesamt 1 mm lang und in 100 Teilstriche unterteilt. Jeder Teilstrich entspricht also 10 µm.

Nun starte ich Fiji und lade dann das Bild mit File->Open. Dann wähle ich das Linien-Tool aus und markiere damit einen Teilbereich, z. B. 20 Striche = 200 µm im Bild mit dem 40x-Objektiv. Um diesen Maßstab nun zuzuweisen wählt man im Menü Analyze->Set Scale aus. Es öffnet sich ein Fenster, in dem die "Distance in pixels" bereits gemäß der markierten Strecke ausgefüllt ist. Nun trägt man unter "Known distance" dann die entsprechende Strecke ein, im oben erwähnten Beispiel wären das dann 200 µm. "Pixel aspect ratio" besagt nur, ob die Pixel quadratisch sind oder nicht und kann daher bei 1 bleiben. Bei "unit of length" trägt man dann noch die Einheit ein. Nicht vergessen das Häkchen bei "Global" zu setzen, denn damit wird der Maßstab auf alle Bilder angewandt, die anschließend geöffnet werden oder schon geöffnet sind. Dann nur noch "Ok" klicken und der Maßstab ist zugewiesen. Dieser Maßstab gilt natürlich nur für das entsprechende Objektiv, mit dem auch das Foto des Objektmikrometers gemacht wurde!

Nun kann man ein weiteres Bild öffnen und Strukturen vermessen, z. B. Sporendurchmesser. Dazu kann man wieder das Linien-Tool verwenden. Nachdem man die Markierung gesetzt hat, kann man mit Analyze->Measure oder Strg-M die markierte Strecke messen. Es öffnet sich ein Ergebnisfenster mit einer Liste, wo die einzelnen Messungen der Reihe nach aufgelistet werden. Dort sind neben der gemessenen Länge nun noch weitere Angaben, z. B. Area (Fläche), Grauwerte (Mean, Min, Max), Winkel (Angle) und weitere. Bei einer Streckenmessung macht die Angabe einer Fläche etc natürlich keinen Sinn. Man kann aber einstellen, was bei den Messungen angezeigt werden soll. Über Analyze->Set Measurements kann man das genau festlegen. Die Ergebnisse im Ergebnisfenster kann man übrigens einfach kopieren und z. B. in Excel einfügen, wenn man möchte.

Das Messen von Flächen und Winkel erfolgt auf die gleiche Weise, nur dass das entsprechende Markierungs-Tool ausgewählt wird.

Einen Maßstabsbalken können wir nun auch einfügen. Dazu markieren wir wieder mit dem Linientool eine gewünschte Strecke, am besten gleich an der gewünschten Position und fügt den Maßstabsbalken nun über Analyze->Tools->Scale Bar ein.

Einen Pfeil kann man einfügen, indem man wieder das Linien-Tool benutzt und dann Image->Annotate->Arrow anwählt.

Zählen von Partikeln (z. B. Sporen) mit Fiji

Wer zum Beispiel wissen möchte, wie viele Sporen in einer angefertigten Sporenspritze enthalten sind, der kann einen Tropfen der Sporensuspension auf einen Objektträger geben und die Sporen zählen. Das könnte man manuell tun, aber mit Fiji/ImageJ geht es eleganter. Natürlich kann man auch andere Partikel zählen, wie z. B. Pollen.

Zunächst wird ein Foto benötigt. Je nach Sporengröße bietet sich das 10x oder 40x-Objektiv an. Die Sporen müssen nicht besonders groß abgebildet werden, lediglich so groß, dass man ihre Form eindeutig erkennen kann. Dieses Foto öffnet man dann in Fiji und wandelt es zunächst in ein 8-bit-Graustufenbild um: Image->Type->8-bit. Um ein verwertbares Bitonbild mit maximalem Kontrast zu erhalten, wählen wir nun Image->Adjust->Threshold und passen die Schieber so an, dass die Sporen allesamt bestmöglich abgebildet werden. Mit Apply bestätigen wir unsere Einstellungen und wenden sie auf das Originalbild an.

Falls sich auf dem Foto einige Sporen berühren, so können diese mit dem Watersched-Filter voneinander getrennt werden, so dass sie später besser gezählt werden können. Process->Binary->Watershed

Nun kann über Analyze->Analyze Particles das eigentliche Zähler-Plugin gestartet werden. Dort können wir nun die Einstellungen so anpassen, dass Sporen zuverlässig erfasst werden, andersförmige oder kleinere/größere Partikel jedoch nicht.

Zusammenfügen mehrerer Aufnahmen zu einem größeren Gesamtbild

Wer mehrere Aufnahmen eines Präparates zu einem Gesamtbild zusammenfügen will, sollte schon bei der Aufnahme darauf achten, dass sie ausreichend überlappen, so dass Fiji sie zusammenfügen kann. Die Aufnahmen kopiert man in einen extra Ordner und öffnet diese dann mit File->Import->Image Sequence. Um die Bilder zusammenzufügen geht man auf Plugins->Stitching->Grid/Collection Stitching. Je nach Reihenfolge der Aufnahmen wählt man den entsprechenden Typ und die Reihenfolge aus und klickt auf Ok. Je nach Anzahl der Bilder und der Auflösung kann das einige Zeit in Anspruch nehmen.

[Lauscher]

Danke für die erste Einführung! Ich werde es bald testen.
Ein Stacking von mehreren Bildern (Aufnahmen verschiedener Schärfeebenen verbinden) scheint wohl auch möglich zu sein, spannend!

[Ständerpilz]

Ja, aber das fand ich relativ kompliziert und die Ergebnisse wenig zufriedenstellend. Für Focus Stacking (auch Deep Focus Fusion DFF oder Extended Depth of Field genannt) würde ich daher eher Photoshop oder das kostenlose CombineZP empfehlen. Es gibt noch andere Stacker, wie Zerene Stacker, die kosten aber alle. Dafür sollen sie auch besser sein, aber wer weiß.

[Ständerpilz]

Mal eine Frage: Welche Anwendungen sind denn für den Hobby- oder Semiprofi-Mykologen und Mikroskopiker interessant? Das Zählen von Partikeln (Sporen) vielleicht? Was sonst noch?

[Lauscher]

Hm, noch habe ich nicht viel Ahnung von der mikroskopischen Pilzbestimmung, weiß also noch kaum, worauf zu achten ist.
Ich weiß noch nicht mal die Bedeutung aller Wörter, die da gebraucht werden (Zystiden z.B.).

Sehr interessant wäre eine Datenbank, die mikroskopische Merkmale zahlloser Pilzarten in Wort und Bild beschreibt!
Dann kenne ich von Pilzbüchern verschiedene Bestimmungsschlüssel, wo man sich in einer Fragenliste von allgemeinen zu immer spezifischeren Merkmalen zur Pilzart durcharbeitet; da gibt es sicher auch Programme zu diesem Zweck.

Bislang ist es mir nicht gelungen, brauchbare Fotos mit dem Mikroskop zu machen, da werde ich noch experimentieren (und vermutlich auch investieren ) müssen. Einfach durchs Okular fotografieren wurde sehr unscharf, bei verschiedenen Einstellungen. Meine Digitalkamera ist ca. 13 Jahre alt, vllt. ist sie einfach nicht dafür geeignet (Canon Powershot G3). Vielleicht habe ich auch einfach noch nicht die richtige Einstellung gefunden. Wenn ich richtig verstehe, muß ich den Focus auf unendlich stellen.

[Ständerpilz]

Datenbanken sind generell nicht schlecht. Auch zu Kultur- und Fruchtungsbedingungen. Könnte man eigentlich machen, mit Google Forms oder als Wiki zum Beispiel. Wie wäre es denn, wenn man das Wiki direkt an dieses Forum "ankoppelt"? Gut wäre eine ausgearbeitete Vorlage mit der groben Struktur eines Eintrags, so dass nicht jeder sein eigenes Süppchen kocht.

Aber ich wollte mit meiner Frage eigentlich mehr auf die Bildbearbeitung von Fotos hinaus, um daraus die erwünschten Daten zu generieren. Wie man Sporen und andere Strukturen vermisst (Länge, Fläche etc) habe ich ja schon gezeigt. Auf ähnliche Art und Weise könnte man auch Mycelwachstum anhand einer Fotoserie festhalten und meinetwegen ein Diagramm mit den Daten erstellen (wozu auch immer das gut sein könnte). Sporen automatisch zählen ginge auch. Tja und sonst fällt mir eben auch nicht viel ein, was man brauchen könnte.

Kleine Kryptogamenflora, Band 2 enthält einen Teil über Basidiomyceten
Vielleicht ist dieser Link ja auch interessant: http://www.geobot.umnw.ethz.ch/teaching ... yceten.pdf

Du hast doch einen Fototubus. Was du brauchst ist eine DSLR und einen passenden Adapter. Es gibt auch Okularkameras, aber die können meist nicht mit einer DSLR mithalten.

[Lauscher]

Vielleicht ist dieser Link ja auch interessant: http://www.geobot.umnw.ethz.ch/teaching ... yceten.pdf

Dieser Link ist sehr interessant, vielen Dank dafür!
Ich konnte ihn noch nicht ausfürlich lesen, doch sehe ich schon, daß er übersichtlich die verschiedenen makroskopischen und mikroskopischen Merkmale gut zusammenfaßt, darstellt und erklärt. Da habe ich noch einige Wissenlücken, die ich damit schließen kann.

Auch zu Kultur- und Fruchtungsbedingungen. Könnte man eigentlich machen, mit Google Forms oder als Wiki zum Beispiel. Wie wäre es denn, wenn man das Wiki direkt an dieses Forum "ankoppelt"? Gut wäre eine ausgearbeitete Vorlage mit der groben Struktur eines Eintrags, so dass nicht jeder sein eigenes Süppchen kocht.

An so etwas habe ich auch schon mal edacht, aber es wieder verworfen, da es einen hohen Pflegeaufwand braucht. Das Forum hat einen Bereich "Pilzportraits", der diesem Zweck gut dient, schon wertvolles Wissen enthält und noch ausgebaut werden kann.

Tja und sonst fällt mir eben auch nicht viel ein, was man brauchen könnte.

Ja, die Software kann einem nicht so ganz viel abnehmen. Vermessen und Stacking geht, der Rest ist Augen-, Gehirn- und Bücherarbeit, sobald es an das Deuten des Gesehenen geht.

Auf ähnliche Art und Weise könnte man auch Mycelwachstum anhand einer Fotoserie festhalten und meinetwegen ein Diagramm mit den Daten erstellen (wozu auch immer das gut sein könnte).

Myzelwachstum wird, soweit ich sehe, noch kaum zur Bestimmung genutzt, vermutlich gibt es da zu wenig Unterschiede bei den Pilzarten. Doch meine ich jetzt schon zu erkennen, daß z.B. manche Pilze dickere, andere dünnere Myzelfäden bilden. Vielleicht werden sich auch Unterschiede in der Verzweigung zeigen. Mal schauen.

Du hast doch einen Fototubus. Was du brauchst ist eine DSLR und einen passenden Adapter. Es gibt auch Okularkameras, aber die können meist nicht mit einer DSLR mithalten.

Ja, da muß ich noch herausfinden, wie ich den Fototubus sinnvoll nutzen kann. Zubehör kostet natürlich wieder Geld, und für das Mikroskop habe ich gerade erst sehr tief in die Tasche gegriffen.

Mit dabei ist ein Okular, dessen Sinn mir erst rätselhaft war, doch vermute ich jetzt, daß es für den Fototubus genutzt werden kann. Es hat nur eine kleine Öffnung (kein Weitfeld), und ein "P" steht drauf, was "Periplan" heißen könnte. Ich weiß zwar nicht, was "periplan" ist, habe das Wort aber schon im Zusammenhang mit Mikrofotografie gelesen.
Wenn ich es direkt in den Fototubus stecke, blockiert es den Schieber, mit dem ich zwischen Okularansicht und Fototubusansicht wechseln kann. Möglicherweise gehört es in einen Adapter, in dem es weniger tief hängt.

Kann ich eine DSLR ohne Objektiv verwenden, was meinst Du? Da habe ich in der Nähe ein halbwegs gutes Angebot gesehen, eine Canon EOS 1000D (ohne Objektive), die Liveübertragung auf den Rechner möglich machen müßte.
Meine Uralt-Canon kann das nicht, habe ich gestern mal ausprobiert.

[Ständerpilz]

Bei der Kultivierung braucht man ja eigentlich nichts bestimmen. Und für eine Bestimmung von gesammelten Pilzen braucht man das Mikroskop wohl hauptsächlich für die Bestimmung der Sporengröße und Form, seltener für andere mikroskopische Merkmale. Die Farbe der Sporen sieht man ja schon beim Sporenabdruck. Wenn man allerdings Pilzsachverständiger werden will und anhand von Essensresten oder Mageninhalt einen Pilz bestimmen muss, dann wird es ohnehin sehr knifflig. Okay, auch bei schwierigen Bestimmungen wäre das bestimmt nützlich. Mir hat es immer gereicht die giftigen von den guten, essbaren Pilzen zu unterscheiden.

Die DSLR musst du am Fototubus natürlich ohne Objektiv verwenden! Dafür ist der Fototubus ja da. Da kommt nur ein Adapter dazwischen, also z. B. von Canon-Bajonett auf was immer das für ein Anschluss am Mikroskop ist. In der Regel hat der Fototubus einen Anschluss für ein bestimmtes Bajonett oder Gewinde, musst du mal gucken. Da es schon älter ist, könnte es auch ein M42-Gewinde sein.

Hier noch ein nützlicher Link: http://www.klaus-henkel.de/mikrofibel.pdf

Live-Bilder auf dem PC brauche ich nicht unbedingt. Viel nützlicher fände ich eine Motorisierung für die Z-Achse mit Anschluss für die Kamera, so dass man automatisiert Foto-Z-stacks für das Focus stacking / Extended Depth of Field machen kann. Auch eine Motorisierung für den Objekttisch (X,Y) wäre denkbar, brauche ich aber eigentlich nicht.

[Lauscher]

Bei der Kultivierung braucht man ja eigentlich nichts bestimmen.

Spannend ist es beim Klonen von schwierigen Wildfunden, ob da wirklich der gewünschte Pilz wächst.

Und für eine Bestimmung von gesammelten Pilzen braucht man das Mikroskop wohl hauptsächlich für die Bestimmung der Sporengröße und Form, seltener für andere mikroskopische Merkmale.

Je nachdem, wie aussagekräftig die Sporen sind - viele sind langweilig eiförmig glatt mit Durchschnittsgrößen. Da können andere Merkmale durchaus hilfreich sein.

Die DSLR musst du am Fototubus natürlich ohne Objektiv verwenden! Dafür ist der Fototubus ja da. Da kommt nur ein Adapter dazwischen, also z. B. von Canon-Bajonett auf was immer das für ein Anschluss am Mikroskop ist. In der Regel hat der Fototubus einen Anschluss für ein bestimmtes Bajonett oder Gewinde, musst du mal gucken. Da es schon älter ist, könnte es auch ein M42-Gewinde sein.

Ich habe mich diese Tage mal etwas schlauer gemacht. Das Mikroskop bietet lediglich eine große Öffnung mit Klemmschraube. Die Firma Hund bietet verschiedene Lösungen an, unter anderem Adapter für Canon DSLRs. Ich schreibe gerade eine email mit Fragen dazu, die Firma Hund ist sehr hilfsbereit. Vielleicht ist auch der Originaladapter von Hund bezahlbar, werde ich bald wissen.
Als Kamera habe ich gerade eine Canon EOS 1000d im Auge, sie kann erschütterungsfrei fotografieren und vom Computer aus gesteuert werden. Gibt es gebraucht ab 100,- Euro.

Viel nützlicher fände ich eine Motorisierung für die Z-Achse mit Anschluss für die Kamera, so dass man automatisiert Foto-Z-stacks für das Focus stacking / Extended Depth of Field machen kann.

Ich lese diese Tage auch über Stacking, anscheinend ist da ein Motor für die Z-Achse wirklich sinnvoll ... au weia, da tut sich schon die nächste Baustelle auf.

Die Mikrofibel ist sehr lehrreich und informativ, danke für den Link! Ich kannte sie allerdings schon, ich habe sie vor dem Kauf ausgiebig gelesen.

[Ständerpilz]

Ich fürchte, diese Adapter sind nicht billig. Üblicherweise kannst du da mit ein paar hundert Euro rechnen.

Auch die Motorisierung der z-Achse ist nicht gerade preiswert. Außer vielleicht, wenn man es selber baut. Andererseits braucht man vieles nicht unbedingt. Man kann z-stacks auch von Hand aufnehmen, nur auf die Dauer ist das halt lästig, wenn man regelmäßig stacks macht. Übrigens kann man damit auch 3D-Rekonstruktionen machen. Dafür muss man nur wissen (oder schätzen), wieviel µm zwischen den Aufnahmen liegen.

Aber eigentlich braucht man das alles nicht unbedingt und der finanzielle und zeitliche Aufwand ist recht hoch.

Pollen hast du sicherlich auch schon unter dem Mikroskop untersucht, oder? Malven sind gut, z. B. Hibiscus.

[Lauscher]

Ich fürchte, diese Adapter sind nicht billig. Üblicherweise kannst du da mit ein paar hundert Euro rechnen.

Hm. Eigentlich sollte das nur ein Rohr mit Schraubgewinde für die Kamera sein, also fast nix dran, was Geld kosten sollte. Ein Okular für den Fototubus habe ich schon. Na, ich lasse mich mal überraschen, was bei meiner Anfrage für Preisantworten kommen. Zur Not muß ich selbst etwas basteln, mit Hilfe von Fremdanbieterteilen. Z.B. gibt es recht billige Teleskopadapter, die ungefähr zum Mikroskop passen könnten. Aber da müßte ich erst einmal besser verstehen, auf welche Entfernung usw. usf. es zu achten gilt. Im Mikroskopforum gibt es allerhand Bastellösungen, doch durchgestiegen bin ich da noch nicht. Optik ist für mich Neuland.

[Ständerpilz]

Oft ist da auch noch eine Linse drin. Ich hatte mal irgendwann geguckt und war erschrocken über die Preise. Aber vielleicht hast du ja Glück.

Ich behelfe mir auch, da ich ja nicht mal einen Fototubus habe. Ich nehme einfach den Binokularkopf ab und stelle da meine Kamera (Lumix GH-3) mit MFT/M42-Adapter einfach drauf. Klappt sogar Ist aber natürlich keine gute Lösung, auch weil die Kamera da nur lose oben auf liegt und daher eventuell fallen könnte, wenn man nicht aufpasst. Aber dafür spare ich einen Haufen Geld und ich habe ja auch gar nicht den hohen Anspruch, damit tolle Bilder aufzunehmen. Als nächstes kommt bei mir auf jeden Fall der Umbau auf LED dran, denn noch behelfe ich mir mit einer untergeschobenen Akku-LED-Leuchte. Ist aber wegen der Spannungsregelung nicht ganz einfach, da es bei Pulsweitenmodulation (PWM) bei Fotos dann zu Streifen kommen kann. Muss mir da noch was überlegen, hatte aber noch keine Lust.

[Ständerpilz]

Ich hab oben mal ein wenig ergänzt.

[Lauscher]

Hallo Oliver,

ich habe meine Kamera mit einem Abflußrohr auf dem Fototubus montiert und erste Fotos gemacht.
Profis mögen sich mit Grausen abwenden, und die Qualität des Fotos ist bei weitem nicht die Qualität des Bildes, das ich im direkten Anblick sehe. Das Scharfstellen auf dem Kameradisplay ist sehr mühsam. Aber immerhin, ein Anfang ist gemacht.

Ich habe das Pulver von Hawlik, von dem auch Deine Kultur abstammt, auf Sporen untersucht, ein Bild gemacht und nach Deiner Anleitung gemessen. Die obere Spore hat ca. die Maße 8,4 x 7,1 mümeter.

[Ständerpilz]

Das sieht noch übel aus Aber es wird sicherlich um Klassen besser, wenn du deine neue Kamera hast!

Ich würde "µm" anstatt "mü" schreiben. Das "µ" kannst du mit <AltGr+M> schreiben