steril im Keller

[malda]

Hallo zusammen,
leider hatte ich letzter Zeit immer wieder Konti Probleme bei der Herstellung von Kräuterseitling Körnerbrut . Von daher hatte ich mich entschlossen ein paar Schritte zurück zu gehen und ein paar Dinge nochmal prinzipiell in meinem Arbeitsumfeld und Handhabung bezüglich Sterilität zu klären.

Prinzipiell gibt es ja viele Möglichkeiten wo/wie so ein Konti ins Glas kommt: Weizen wurde nicht richtig autoklaviert, „Lüftung“ im Glas lässt irgendwann Keime durch, Kontis beim Beimpfen (öffnen des Glases),...
mein Verdacht war, dass die Lüftung nicht nur Luft durchlässt... daher habe ich einfach gewässerten Weizen in identische Gläschen abgefüllt, die mit unterschiedlichen Luftaustausch Möglichkeiten versehen waren. Nach dem Autoklavieren sind die Gläschen ohne weiteres Zutun ca 1 Monat gestanden. Getestet wurde 1-fach Micropore, 3-fach Micropore, Zigarettenfilter, Aquarienwatte und Haushaltsschwamm.
Das Ergebnis hat für mich eine klare Botschaft - ab jetzt nur noch 3-fach Micropore! Sicher ist auch Aquarienwatte oder Haushaltsschwamm brauchbar, aber einfacher und vor allem reproduzierbarer - unter meinen Bedingungen - ist Micropore.

1-fach Micropore:

3-fach Micropore:

Zigarettenfilter:

Aquarienwatte:

Haushaltsschwamm:

Im nächsten Test wollte ich klären, wann denn eigentlich (hauptsächlich) meine Kontaminationen stattfinden/fanden. Meine Annahme war, dass unmittelbar nach dem Autoklavieren beim Belüfteten des Autoklaven Kontis in die Gläser gelangen. Daher habe ich ein Set Gläschen erst nach dem belüfteten zugeschraubt. Ergebnis: die Gläschen bleiben sauber/steril! Damit scheint die Belüftung des Autoklaven keine besondere Konti Quelle zu sein. Also kommen die Kontis über die Zeit in die nicht optimal abgedichteten Gläser. Um das zu prüfen habe ich Gläschen autoklaviert, abkühlen lassen, anschließend aufgeschraubt und den aufgeschraubten Deckel auf dem Gläschen belassen. Ergebnis: der Weizen kontaminiert.
Und da ich - seitdem ich Micropore verwende - kaum Kontis in der Körnerbrut habe, ist das "sterile" beimpfen mit bewachsenen Agar Stücken an der Brennerflamme scheinbar auch kein Problem.
Das ist alles nix Neues, aber vielleicht ist es gar nicht schlecht, wenn man das nochmal sieht.

[mariapilz]

interessantes Thema

Daher habe ich ein Set Gläschen erst nach dem belüfteten zugeschraubt. Ergebnis: die Gläschen bleiben sauber/steril! Damit scheint die Belüftung des Autoklaven keine besondere Konti Quelle zu sein. Also kommen die Kontis über die Zeit .....

Wie "belüften" ...Das verstehe ich nicht. Meinst du ...Wenn der DDKT abkühlt?
Hast du einen DDKT?
Wie lange autoklavierst du?
Welche Kontis kommen? Schimmel? Bakterien?

[malda]

Ich hab nen kleinen älteren Autoklaven (Prunkstück meiner Pilzausstattung) und den machst du erst zu, wenn sich bei 100° die Luft Wasserdampf gesättigt hat. Das hat zur Folge, dass wenn der Autoklav später wieder abkühlt und so bei 70-80 ° ist, sich im Inneren einen ziemlichen Unterdruck aufgebaut hat. Wenn man nun das Ventil öffnet und belüftet lässt man ja unsterile Raumluft rein - in den Autoklaven (und natürlich auch in die Gläschen). Das hätte ein Moment sein können, wo ich mir offene / undichte Gläschen kontaminiere, ist aber nicht so - zum Glück.
Weizen autoklaviere ich 2h bei ca 2 bar eher etwas drunter bisher egal welches Gebinde. An Kontaminationen habe (bzw hoffe hatte) ich oft grüne Vertreter ohne näheres zu Wissen tippe ich da auf Trichoderma. Mit den Sporen habe ich mir hier den Keller wohl schon ordentlich versaut....

[mariapilz]

ahh Ein richtiger Autoklav. Nobel.

Als ich noch Gläser verwendet hatte, habe ich in ein ca. 5x5 mm großes Loch im Deckel einen halben Wattepad reingesteckt. (echt fest drinnen... Ein Zigarettenfilter lässt sicher mehr durch) ich hatte nie Probleme mit Schimmel.... Eher Bakterien... Das lag aber am DDKT und seiner unzureichenden Hitze.

...ich habe schon öfter gelesen, dass man ein Tuch mit Desinfektionsmittel/ Alkohol über das Ventil vom DDKT legen kann. .. Während der Abkühlphase.

[malda]

ahh Ein richtiger Autoklav. Nobel.

Als ich noch Gläser verwendet hatte, habe ich in ein ca. 5x5 mm großes Loch im Deckel einen halben Wattepad reingesteckt. (echt fest drinnen... Ein Zigarettenfilter lässt sicher mehr durch) ich hatte nie Probleme mit Schimmel.... Eher Bakterien... Das lag aber am DDKT und seiner unzureichenden Hitze.

...ich habe schon öfter gelesen, dass man ein Tuch mit Desinfektionsmittel/ Alkohol über das Ventil vom DDKT legen kann. .. Während der Abkühlphase.

Guter Tip mit dem Tuch! Das merk ich mir.

Und heute nimmst du Tüten?
Bin auch gerade dabei das zu testen, hat echt Vorteile (größeres Volumen, super bröselbar).

[mariapilz]

Ja. unicorn. 3,5 korn brut bekomme ich locker in meinen 13l DDKT. 3 Stunden 30 Minuten Vollgas. Nach dem kochen lassen ich den Druck im Topf entweichen und nehme anschließend den noch relativ heissen sack heraus(sonst dauerts zu lange) Da ich aber auch keinen sauberen platz habe, verschweiße ich den Sack schon vor dem kochen. Damit er aber nicht platzt (ich weiß nicht ob er wirklich platzen würde) schneide ich die Versiegelung über 1 cm wieder auf, um dieses Loch dann mit Micropore wieder zu verschließen

die Vorteile hast du schon erwähnt. ... Was manchmal nervt...
Das Schweißgerät (mein billiges) bzw. die Naht ist manchmal nicht ganz dicht. Vor allen nach dem impfen, denn der Sack ist feucht und etwas zerknautscht. Deshalb klebe ich noch mit einem Klebeband zu
Der Aufwand lohnt sich...für 3,5 kg brut.

[GrafDracula]

Der Aufwand lohnt sich...für 3,5 kg brut.

Vor allem auch weil du "3 Stunden 30 Minuten Vollgas" sterilisierst ... die Zeit, die sonst umsonst verplämpert wäre würde mich da am Meisten ank...

[malda]

KS Körnerbrut in Gläschen geht mittlerweile ziemlich problemlos ohne Flow/Hepa. Richtig schwierig wird’s allerdings, wenn man Körner in Tüten machen will und hat keine Flow/Hepa ... hier hab ich am Brenner eine ziemlich große Ausfallquote (eigentlich nur durch den grünen – vermutlich Trichoderma). Aber irgendwie muss das doch auch gehen!?
Vielleicht klappt's ja mit tricksen: Dazu habe ich über die Körner eine Schicht Mist gepackt. Idee dahinter ist, dass die Mist-Schicht die Körner nach dem autoklavieren vor Kontis schützt. Dazu ist zu sagen, dass bei all meinen Mist Ansätzen eigentlich so gut wie nie was grünes auftrat, Trichoderma kann also mit Mist (zumindest mikrowellisiertem) wenig anfangen und der KS sollte einen deutlichen Vorteil haben. Wenn ich nun die dünne Mistschicht mit KS Myzel beimpfte so sollte es der Theorie nach den Mist am schnellster durchwachsen und als erste/einzige in die sterile Körnerschicht vordringen (so meiner Hoffnung). Beimpft habe ich das ganze nach dem Autoklavieren mit 2 Teelöffeln KS Körnerbrut - ohne Brenner, ohne Hepa, einfach so im Keller auf der Werkbank. Mal schauen...

[Mycelio]

Sag mal, wäre es da nicht viel praktischer, die Beutel per Spritze flüssig zu beimpfen?
Wenn Körnerbrut in kleinen Gläsern gut klappt, wüsste ich einen Trick, für den man nicht mal Flüssigkulturen ansetzen muss.

Grüße, Carsten

[malda]

Sag mal, wäre es da nicht viel praktischer, die Beutel per Spritze flüssig zu beimpfen?
Wenn Körnerbrut in kleinen Gläsern gut klappt, wüsste ich einen Trick, für den man nicht mal Flüssigkulturen ansetzen muss.

Also von allem Flüssigem hab ich bis jetzt die Finger gelassen. Flüssigkultur ohne 100% sauberes Arbeiten empfinde ich als Harakiri und da ich keine Flow/Hepa habe... eine Lösung wäre natürlich sich einen Hepa zu bauen/kaufen, aber das wäre ja zu einfach
… zumal ich wirklich Platzprobleme bekomme hier noch irgendetwas unterzustellen. Ganz abgesehn davon ist es durchaus reizvoll Problemchen mit pfiffigen Tricks zu lösen. Apropos Trick, Körnerbrut in kl. Gläschen klappt 100%... ?

VG
Dietmar

[mariapilz]

Sag mal, wäre es da nicht viel praktischer, die Beutel per Spritze flüssig zu beimpfen?
Wenn Körnerbrut in kleinen Gläsern gut klappt, wüsste ich einen Trick, für den man nicht mal Flüssigkulturen ansetzen muss.

Grüße, Carsten

Trick? Mag ich.
meinst du... Wasser ins Brutglas injizieren - schütteln - und wieder absaugen?

[Mycelio]

Also von allem Flüssigem hab ich bis jetzt die Finger gelassen. Flüssigkultur ohne 100% sauberes Arbeiten empfinde ich als Harakiri und da ich keine Flow/Hepa habe... eine Lösung wäre natürlich sich einen Hepa zu bauen/kaufen, aber das wäre ja zu einfach
… zumal ich wirklich Platzprobleme bekomme hier noch irgendetwas unterzustellen. Ganz abgesehn davon ist es durchaus reizvoll Problemchen mit pfiffigen Tricks zu lösen. Apropos Trick, Körnerbrut in kl. Gläschen klappt 100%... ?

Bzgl. Harakiri hast du meine volle Zustimmung, jedoch...

Trick? Mag ich.
meinst du... Wasser ins Brutglas injizieren - schütteln - und wieder absaugen?

Bingo!
Z.B. winzige Gläser (wie die von Kapern oder Meerrettich) mit nem Teelöffel Getreide drin.
An Dietmars Stelle würde ich - sobald die Körner besiedelt sind - so ein Glas schütteln, eine Lage Micropore abziehen, reinstechen, Wasser reindrücken, schwenken und die Myzelsuppe zurück in die Spritze ziehen.
Ich bevorzuge Alufolie über der Öffnung der Gläser, aber das wäre nicht kellertauglich. Nach den Fotos und der Beschreibung im ersten Beitrag würde ich davon ausgehen, dass sich die eine oder andere Milbe irgendwo durchgequetscht hat.
Grüße, Carsten

[malda]

Trick? Mag ich.
meinst du... Wasser ins Brutglas injizieren - schütteln - und wieder absaugen?

Bingo!
Z.B. winzige Gläser (wie die von Kapern oder Meerrettich) mit nem Teelöffel Getreide drin.
An Dietmars Stelle würde ich - sobald die Körner besiedelt sind - so ein Glas schütteln, eine Lage Micropore abziehen, reinstechen, Wasser reindrücken, schwenken und die Myzelsuppe zurück in die Spritze ziehen.
Ich bevorzuge Alufolie über der Öffnung der Gläser, aber das wäre nicht kellertauglich. Nach den Fotos und der Beschreibung im ersten Beitrag würde ich davon ausgehen, dass sich die eine oder andere Milbe irgendwo durchgequetscht hat.
Grüße, Carsten

Klingt nach machbar... probier ich sofort aus – danke!
Bin gespannt – die letzte Super-Einfach-Methode, die ich ausprobiert habe ging vermutlich gehörig schief => ich hatte versucht bewachsene KS Agar-Platten mit etwas Wasser zu zerhäckseln und damit mein mikrowellisiertes Substrat zu beimpfen. War ein Trick den ich auf Pilz-Kultur.at gefunden habe. Und ich vermute in der kommerziellen Produktion in asiatischen Ländern wir das KS Substrat auch „nur“ mit Flüssigmyzel beimpft. Der Trick wollte aber nicht. Ich warte nun bald 3 Monate auf sichtbares Myzel – demnächst mache ich den Ansatz mal auf und gucke ob innen irgenwas passiert ist.

[Mycelio]

Eins noch: Rechne damit, dass ein Teil des Wassers zwischen den Körnern bleibt und sich nicht wieder einsaugen lässt.
Viel Spaß!

[malda]

Leider hat mein "Trick" mit Mist zu überschichten nicht funktioniert. Als mir das „Grün“ zu viel wurde hab ich abgebrochen... scheinbar kommen Kontis am Rand bis zu den Körnern. Schade eigentlich....

Dafür sieht die Methode von Carsten vielversprechend aus . Zwar hab ich noch viel Ausschuss, aber ich habe ein sehr gutes Gefühl das in den Griff zu kriegen. Bisher hab ich die Methode 3 mal getestet:
1. Ansatz mit 3 Tüten:
die erst beimpfte Tüte ist sauber und die Körner werden langsam besiedelt. Die beiden anderen sind kontaminiert. Das waren definitiv "Handlingsfehler", ich weiss auch was schief ging.

2. Ansatz mit 2 Tüten:
Scheint gut zu laufen - Körner werden besiedelt.

3. Ansatz mit 2 Tüten:
beide Tüten kontaminiert. Auch hier habe ich eine Vermutung wo der (Handlings) Fehler lag - kommt nicht wieder vor. Alternativ ist nicht auszuschließen, dass schon das Körner Glas kontaminiert war.

Auffällig bei allen erfolgreichen Ansätzen ist, dass die Myzel-Fragmente wohl durch die Körner durchrauschen, sich unten sammeln und von dort die Besiedlung startet. Hätte ich so nicht vermutet. Ist das typisch bei Flüssigmyzel? Vielleicht Versuche ich mal die Myzel-Fragmente in deutlich weniger Flüssigkeit aufzunehmen (bisher ca 10 ml pro Beutel)...